Čeští vědci se snaží odhalit virus i bez izolace RNA kyseliny. Odhalí ho rozsvícená modrá LED lampa

Čeští vědci se snaží dokončit vývoj spolehlivého testu na koronavirus, který by se obešel bez nákladného laboratorního vybavení. Zkoušejí využít metodu izotermální amplifikace (LAMP), která by umožnila detekovat virus v jediné zkumavce bez potřeby izolovat ribonukleovou kyselinu (RNA). Test začali vyvíjet v několika výzkumných institucích. Nejdál jsou ve výzkumném centru Biocev, kde teď shánějí vzorky ze slin.

Praha Sdílet na Facebooku Sdílet na Twitteru Sdílet na LinkedIn Tisknout Kopírovat url adresu Zkrácená adresa Zavřít

Vizualizace pomocí fluorescence | Foto: M. Kuthan | Zdroj: BIOCEV

V potemnělé laboratoři leží řady malých zkumavek s tekutinou ozářené modrou LED lampou. Když se na ně podívám přes jednoduchý filtr, některé z nich se rozzáří fosforovou barvou. Jedovatě zelená značí přítomnost koronaviru, který už ale podle profesorky Zdeny Palkové nemůže nikoho ohrozit.

Místo odběrů z nosu stačí plivnout. Laboratoře zkouší unikátní metodu testování na koronavirus

Číst článek

„V každé té zkumavce jsou jiné vzorky z odběrů z nosohltanu. Nejsou nijak čištěné. Je to nativní inaktivovaný vzorek. Pokud zkumavky nesvítí, znamená to, že jsme v nich nedetekovali virus. V těch, které svítí, se vyskytuje virová RNA,“ vysvětluje Zdena Palková, která vede laboratoř molekulární a buněčné biologie kvasinkových populací výzkumného centra BIOCEV Akademie věd ČR a Univerzity Karlovy. Loni na jaře spolu se svým týmem začala vyvíjet testy na koronavirus s využitím metody LAMP, kterou vědci využívají bezmála 20 let a slouží k rozpoznání přítomnosti virů a bakterií.

Záření podle množství viru

„V podstatě jde o to, že máte ve zkumavce předpřipravenou reakční směs. Do ní přidáte testovaný vzorek. Potom už následují jenom dva kroky inkubace při konstantní teplotě okolo 65 stupňů. Reakce trvá zhruba hodinu až hodinu a půl, kdy můžete vizualizovat vzorek na přítomnost fluorescence,“ popisuje další člen týmu Michal Čáp z katedry genetiky a mikrobiologie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy. Vzorky s velkou virovou náloží se rozsvítí brzy, ty, kde je viru málo, až později.

Pozitivní vzorky lze jednoduše vizuálně odlišit od negativních | Foto: M. Kuthan | Zdroj: BIOCEV

„Hlavní výhodou je, že ten materiál není potřeba žádným způsobem izolovat, což je ta nejnákladnější a časově nejnáročnější část u klasických PCR testů. Stačí nám naprosto základní laboratorní vybavení v hodnotě několika tisíc korun.“ Podle Čápa by tak s využitím této metody šlo vytvořit jednoduché mobilní testovací laboratoře. „Můžeme si představit jednoduchou levnou krabičku, která bude udržovat požadované teploty a poskytovat modré světlo s filtrem. To může být na výrobu velice levná záležitost. Takovou testovací sadu by pak šlo používat i v polních podmínkách.“

Metodu už vědci z Biocevu validovali a u vzorků z nosohltanu dosáhli kvality, která je podle Palkové srovnatelná s PCR testy:

„Korelace mezi naším testem a PCR je poměrně vysoká. U silných vzorků (s vysokým obsahem viru - pozn. red.) se dosahuje korelace 98 %. U středních vzorků je to 95 %. U slabších vzorků je korelace o něco nižší, ale to mluvím o poměrně hodně slabých vzorcích.“

Členové výzkumného týmu při práci v laboratoři | Foto: M. Kuthan | Zdroj: BIOCEV

Podobnou metodu zkoušel v terénu využít imunolog Karel Drbal z katedry buněčné biologie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy, který se snažil vytvořit mobilní laboratoř v domovech seniorů v rámci pilotního testu. „Nakonec jsme se pokorně vrátili do laboratoře, protože ani ty LAMP testy nejsou tak jednoduché na kvalitní provedení. Museli jsme testovat mnoho kombinací, abychom zajistili, že budou vykazovat nízkou úroveň falešné pozitivity, abychom nepanikařili tím, že bychom indikovali pozitivitu u jedinců, kteří budou ve skutečnosti negativní. To je podle mě hlavní nedostatek těchto testů,“ podotýká Drbal, který se vedle výzkumné činnosti také věnuje PCR diagnostice v komerční sféře.

Testy z hrubých vzorků

„Myslím si, že optimalizace LAMP testů je mnohem složitější věc než optimalizace PCR testů, které za sebou mají čtyřicet let vývoje. LAMP je ve vědeckém prostoru znám necelých dvacet let. A ty testy jsou ještě dnes pod patenty. To znamená, že nakonec ani nejsou levnější, protože pak musíte platit licenční poplatky, když se jedná o komerční řešení,“ upozorňuje.

Jedovatě zelená značí přítomnost koronaviru | Foto: M. Kuthan | Zdroj: BIOCEV

Do vývoje LAMP testů na koronavirus se pustil také tým z České zemědělské univerzity vedený virologem Jiřím Černým. Když je vyzkoušeli s izolací RNA, fungovaly dobře. Ale na takzvaných špinavých vzorcích už ne. „Bez izolace RNA se nám senzitivita výrazně zhoršila a testy už nebyly aplikovatelné v praxi. Ukázalo se, že čím větší množství proteinů ve vzorku je, tím nižší je citlivost. V současné době se tuto překážku snažíme překonat, abychom mohli dělat testy i z hrubých vzorků. Máme několik nápadů na to, jak se přebytečných proteinů zbavit, které ještě potřebujeme laboratorně vyzkoušet,“ popisuje Jiří Černý z Fakulty tropického zemědělství ČZU s tím, že by rádi v budoucnu připravili LAMP testy, které by dokázaly v jedné zkumavce detekovat více patogenů nebo více cílů na molekule viru SARS-CoV2.

Firmy by od státu mohly dostat příspěvek na testování zaměstnanců, šlo by i o kloktací nebo žvýkací testy

Číst článek

Tyto překážky se vědcům v Biocevu podařilo překonat. „Používáme jinou detekci, než se obvykle používá. Běžně používané detekce měly velmi špatnou reprodukovatelnost v přírodních vzorcích a odběrech. To znamená, že obsah vzorků výrazně ovlivňoval barevnou detekci, takže to pak byly falešně negativní a falešně pozitivní výsledky. Další věc byla, že jsme pečlivě odladili kombinaci enzymů, které jsou v reakční směsi. To je velmi důležité. Hráli jsme si různými variantami polymeráz a jejich kombinací, až jsme dostali sadu, která vypadá velice dobře,“ říká Palková. 

Stovky vzorků slin

Na vzorcích z nosohltanu tento test funguje dobře. Teď se ho snaží adaptovat na sliny, které by pak šlo získávat samo odběrem. „V tuto chvíli urgentně potřebujeme velké množství vzorků slin a určitě k tomu potřebujeme informaci z PCR o tom, které z nich byly pozitivní a které negativní,“ podotýká profesorka Palková z Biocevu s tím, že pokud by na tomto chtěla nějaká instituce a odběrové místo spolupracovat a poskytnout vzorky slin, budou rádi. „Samozřejmě může složení slin ovlivnit inhibici reakce z hlediska enzymů, které tam dáváme. Potřebujeme několik stovek vzorků slin otestovat a případně mírně zmodifikovat naši metodu. Máme několik nápadů, jako to udělat,“ dodává Palková. 

Čeští vědci se snaží dokončit vývoj spolehlivého testu na koronavirus | Foto: M. Kuthan | Zdroj: BIOCEV

LAMP testy na koronavirus s využitím vzorků z nosohltanu bez potřeby izolovat RNA už vyvinuli a zvalidovali také badatelé z Centrální laboratoře Genomika institutu CEITEC Masarykovy univerzity. Na vývoj získali grant od Technologické agentury ČR. Licence je teď k dispozici komerčním výrobcům.

Snahou je vyvinout spolehlivý test, který by se obešel bez drahého laboratorního vybavení potřebného u PCR diagnostiky a zároveň by byl spolehlivější než antigenní rychlotesty. Cenově by měl být test v porovnání s PCR podle Palkové výrazně levnější. PCR diagnostika, která dnes platí za zlatý standard, má ovšem nadále výhodu v tom, že dokáže přesněji rozeznat virovou nálož ve vzorku i rozdílné mutace koronaviru.

Štěpán Sedláček Sdílet na Facebooku Sdílet na Twitteru Sdílet na LinkedIn Tisknout Kopírovat url adresu Zkrácená adresa Zavřít

Nejčtenější

Nejnovější články

Aktuální témata

Doporučujeme